BIOANALYSE L3 2B2M ET BCP

TP 4 : BLAST, ALIGNEMENT MULTIPLE, SIGNATURE PROTEIQUE

OBJECTIFS DU TP

Les serveurs que vous allez utiliser :
EBI
ExPASy
NCBI
Phylogeny.fr



Lors du TP3, vous avez étudiez le gène BCL2 humain. Nous allons maintenant chercher des homologues à ce gène, construire un alignement multiple et une signature protéique.


PREMIIERE PARTIE : recherche d'homologues avec BLASTN

  1. A partir de la séquence de l'ARNm de l'isoforme 1 (NM_000633), lancer un BLASTN contre la banque nucleotide collection nr/nt (cochez la case Exclude models XM/XP)
  2. Regardez le résultat du BLAST et répondez aux questions suivantes :
  1. Relancer un BLASTN en précisant l'organisme que vous cherchez : quel est le résultat ?
  2. Des alignements avec des E-value >1 vous semblent-ils être de bons alignements ?
  3. Lancer un BLASTX toujours sur le même organisme et contre le banque nr : intérêt(s) de BLASTX ?
En fait, on travaillera plutôt au niveau protéique pour chercher des homologues, pour les raisons déjà vues au TP2 (conservation uniquement des CDS, pas sur les UTR, pas de problème de variation d'usage des codons donc taux d'identité plus élevé, et notion de similarité des acides aminés). Ici on connait la protéine donc mieux vaut faire un BLASTP qu'un BLASTX.


DEUXIEME PARTIE : recherche de protéines homologues à BCL2 humaine
  1. Récupérer la protéine codée par l'ARNm NM_000633, et utiliser maintenant BLASTP, contre la banque SwissProt
  2. Regardez l'alignement avec la séquence BCL2-like protein 1 de poulet Q07816
  1. Sélectionnez les séquences qui vous semblent homologues à notre séquence (filtre avec alignement sur les 2/3 de la séquence query, et identité à plus de 30%)
  2. Récupérez les séquences en cliquant sur GenPept puis FASTA text.
  3. Copiez les séquences dans un editeur de texte et renommer les pour avoir des noms courts : changer le nom dans l'entête FASTA, en gardant nom de protéine et de l'organisme, et sans espace (mais des tirets - ou _)
    Vous pouvez garder le nom fourni dans SwissProt. Par exemple :
    >gi|231632|sp|P10415.2|BCL2_HUMAN RecName: Full=Apoptosis regulator Bcl-2
    devient :
    >BCL2_HUMAN


TROISIEME PARTIE : recherche d'homologues chez la nématode (Caenorhabditis)

Le nématode étant assez eloigné de l'homme il n'y avait probablement pas de séquences dans le BLASTP précédent. Vous allez maintenant utiliser le programme PsiBLAST pour chercher des homologues chez cet organisme
  1. A partir de la protéine précédente, sélectionner la banque nr cette fois, préciser l'organisme Caenorhabditis et choisir PsiBLAST dans la sélection des programmes de BLASTP.
  2. Sélectionner les séquences qui s'alignent sur la zone du domaine BCL2-like (cocher ou décocher les cases à droite) et lancer la 2e itération
  3. Observer les changements dans les résultats. Sélectionner les premières séquences, toujours alignées sur le domaine BCL2-like. Ne prenez pas les séquences de PDB (numéro d'accession commence par un chiffre). 1 séquence par organisme suffit !
  4. Rajouter ces quelques séquences à votre jeu de séquences précédent, en les renommant également.

QUATRIEME PARTIE : Alignement multiple et construction d'une signature protéique
  1. Sur le site de l'EBI utiliser MAFFT pour construire un alignement multiple (choisir Output format : ClustalW) : regarder l'alignement, et garder cette page ouverte !
  2. Visualiser l'alignement (onglet Result Viewers) soit avec Jalview (sur les PC, dans Programmes) soit avec Mview (en ligne) : regarder l'alignement. Jalview ou Mview sont juste des interfaces de visualisation. : Jalview ou Mview sont juste des interfaces de visualisation. Regarder l'alignement. Où sont les parties conservées ? Voyez-vous apparaitrent des groupes de séquences ?
  3. Copier le même alignement dans WebLogo : modifier le paramètre Logo range pour cibler la zone conservée (voir selon votre alignement) et Logo Size per Line : 40 x 5 cm
  4. Construire une signature PROSITE à partir de votre alignement (n'utilisez pas le LOGO, sinon vous ne voyez pas précisément les zones de gap)
    Pour vous aider, voici la début d'une signature. Vous avez probablement quelque chose d'approchant dans votre alignement
Q-L-x(3)-P-x(6)-[FY]-x(2)-V-x(3)-[LVF]-[FGD]-x(2,8)-[GPS]
Q-L : il n'y a que Q puis L dans 2 colonnes successives de l'alignement
x(3) : 3 colonnes avec des acides aminés variables
[FY] : dans cette colonne seuls F ou Y
x(2,8) : zone avec un gap. Entre 2 et 8 résidus, suivant les séquences
  1. Tester votre signature sur ScanProsite (choisir l'option 2) contre SwissProt ou trEMBL (plus long !) : les séquences obtenues appartiennent-elles à la famille des BCL2 ou BCL2-like ? Retrouvez-vous les mêmes organismes que précédemment ? en avez-vous d'autres ?
  2. Regarder, par exemple dans le premier lien UniProt, comment est caractérisé ce domaine dans les banques : dans la partie Family and domain databases cliquez sur View potein in PROSITE : est-ce-que ce sont plutôt des signatures ou des profiles ?

    3. BONUS pour ceux qui ont encore du temps :
  3. Pour finir, vous pouvez générer un arbre phylogénétique de vos séquences : aller sur Phylogeny.fr dans Phylogeny Analysis => "One click" et mettre directement les séquences non alignées en format FASTA. Vous pouvez aussi utiliser le mode "à la carte" : cochez Gblocks, FastME et Newick Display puis cliquer sur Create workflow et coller votre alignement multiple. Essayer de comprendre l'histoire de cette famille et de voir les noeuds de spéciation et de duplication.



















résultat du BLASTP
jeu de séquences
ScanProsite contre trEMBL
arbre phylogénétique